目前已上市的納(na)(na)米(mi)抗體(ti)藥物共有(you)三(san)種(zhong)，包(bao)括(kuo)Ablynx的納(na)(na)米(mi)單抗卡(ka)拉西單抗(Caplacizumab)和(he)雙特異(yi)性抗體(ti)Ozoralizumab以及康寧(ning)杰(jie)瑞(rui)的恩沃利單抗(Envafolimab)。此外，還(huan)有(you)多個(ge)納(na)(na)米(mi)抗體(ti)進入(ru)到臨床(chuang)研究階(jie)段，廣(guang)泛分布(bu)在(zai)包(bao)括(kuo)腫(zhong)瘤、神經系統疾(ji)病、免疫系統疾(ji)病等各(ge)種(zhong)領域(yu)。

納米抗體的人源化改造

納米抗體

納米抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)由于其穿透性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)好、結合(he)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)強(qiang)、穩定性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)高等(deng)特點，使其不僅作為單(dan)抗(kang)(kang)藥(yao)物性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)質優越(yue)，并且(qie)便于開發雙特異性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)藥(yao)物、抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)藥(yao)物偶(ou)聯物(Antibody-drug conjugate, ADC)以及(ji)嵌合(he)抗(kang)(kang)原受(shou)體(ti)(ti)(ti)(Chimeric antigen receptor, CAR)細胞藥(yao)物等(deng)，因此廣(guang)受(shou)藥(yao)物研究者青睞[1]。

駝科動物(wu)外周血中會產(chan)生兩(liang)種不同(tong)類型的(de)(de)IgG抗(kang)體(ti)，如下圖1所示，一(yi)類是(shi)由兩(liang)條重(zhong)鏈(lian)(lian)和(he)兩(liang)條輕鏈(lian)(lian)組成的(de)(de)常規IgG1抗(kang)體(ti)(MW~150 kDa)，另一(yi)類則是(shi)包括IgG2和(he)IgG3(MW~90 kDa)在內的(de)(de)缺(que)少輕鏈(lian)(lian)及重(zhong)鏈(lian)(lian)CH1結構域(yu)(yu)的(de)(de)重(zhong)鏈(lian)(lian)抗(kang)體(ti)(HCAb)。重(zhong)鏈(lian)(lian)抗(kang)體(ti)的(de)(de)可變區稱為單(dan)域(yu)(yu)抗(kang)體(ti)(sdAb)，也稱為納米抗(kang)體(ti)或VHH。VHH被認為是(shi)最小的(de)(de)抗(kang)原(yuan)結合單(dan)位。

圖1 駝科動物(wu)外周血中的抗體

人源化改造

為了降(jiang)低潛(qian)在的(de)免(mian)疫(yi)反應，提(ti)高安全(quan)性(xing)，用于(yu)(yu)人(ren)體(ti)(ti)(ti)的(de)抗體(ti)(ti)(ti)藥(yao)物常常需要進(jin)行人(ren)源(yuan)化改造。由于(yu)(yu)VHH抗體(ti)(ti)(ti)體(ti)(ti)(ti)積小(xiao)、具有免(mian)疫(yi)原性(xing)的(de)表位少且血(xue)清半衰期較短等(deng)，人(ren)們普(pu)遍認為其(qi)免(mian)疫(yi)原性(xing)顯著(zhu)低于(yu)(yu)傳統(tong)雙(shuang)鏈抗體(ti)(ti)(ti)[2]。但(dan)是(shi)(shi)VHH中較長的(de)的(de)CDR1和CDR3區以及非(fei)經典的(de)二硫鍵是(shi)(shi)人(ren)類基(ji)因庫中不存在的(de)構(gou)象(xiang)(如圖2所示)，可能存在由構(gou)象(xiang)表位引(yin)發的(de)免(mian)疫(yi)原性(xing)的(de)潛(qian)在風險。

Noncanonical disulfide linkage

圖2 VH與VHH的結構示(shi)意(yi)圖[3]

此外，VHH的(de)(de)CDR和FR區(qu)高水平的(de)(de)體(ti)細胞超突(tu)變(bian)也限制了(le)VHH與人(ren)類免疫球蛋白重鏈(lian)可變(bian)區(qu)基因(yin)(Immunoglobulin heavy-chain variable gene, IGHV)序(xu)列的(de)(de)同源性[4]。因(yin)此，在開發VHH藥(yao)物(wu)時出于藥(yao)效及安(an)全性考慮會對(dui)駝科(ke)VHH進行人(ren)源化(hua)改造(zao)。目前已上(shang)市的(de)(de)三款VHH抗體(ti)藥(yao)，均進行了(le)人(ren)源化(hua)改造(zao)。

人源化納米抗體純化的挑戰

為了避免引入更多(duo)(duo)風(feng)險因(yin)素，大多(duo)(duo)情況下制藥企業(ye)不(bu)會在納(na)米(mi)(mi)抗體(ti)上(shang)添加Flag、His等(deng)標簽蛋白(bai)，且納(na)米(mi)(mi)抗體(ti)的人(ren)源(yuan)化(hua)(hua)改造可能會導致原本針對駝科納(na)米(mi)(mi)抗體(ti)的純化(hua)(hua)方法(fa)不(bu)適用，這為人(ren)源(yuan)化(hua)(hua)納(na)米(mi)(mi)抗體(ti)的純化(hua)(hua)帶來(lai)了很多(duo)(duo)障(zhang)礙。

有些(xie)企業會(hui)設計Fc融(rong)合(he)的納米抗體(ti)，在延長納米抗體(ti)半衰期的同時可以使(shi)用(yong)Protein A等(deng)方(fang)式對融(rong)合(he)的納米抗體(ti)進行純化。但是融(rong)合(he)Fc的納米抗體(ti)也會(hui)失(shi)去它(ta)分子量小的優勢，同時可能會(hui)引發非特異性(xing)結合(he)(許多細胞具有Fc受體(ti))以及Fc介導的補體(ti)反應。

所以有些(xie)特(te)定的(de)(de)情況下(xia)，還是需(xu)要設計Tag-free的(de)(de)納(na)米(mi)抗體藥(yao)物(wu)，但是目前尚無有效的(de)(de)親和純(chun)化Tag-free的(de)(de)人源化納(na)米(mi)抗體的(de)(de)方法。    

應對策略推薦

GenScript開(kai)發(fa)了(le)Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF(GenScript，L00951)，可助(zhu)力人(ren)源化納米抗體的純化及藥(yao)物的開(kai)發(fa)。

結構及原理

Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF通過共價偶聯的(de)(de)方式(shi)將Anti-Humanized VHH Antibody偶聯到(dao)高度交聯的(de)(de)瓊脂糖(tang)微球(qiu)上(shang)，細胞裂解物中(zhong)的(de)(de)人源化VHH單域抗(kang)體可(ke)以(yi)與偶聯到(dao)填料上(shang)的(de)(de)Anti-Humanized VHH Antibody特異性結(jie)合(he)，從而達到(dao)純化人源化VHH的(de)(de)目的(de)(de)(如圖3所示)。

圖3 Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF

結構和純化(hua)原理(li)示意圖

應用場景

Anti- Humanized VHH Affinity Resin FF的填料是在瓊脂糖凝膠(jiao)4B的基礎上經過(guo)化(hua)學交聯形成的高度交聯的介質，因此(ci)化(hua)學穩定性(xing)和(he)物理剛(gang)性(xing)顯著增強。除(chu)了可通過(guo)柱(zhu)層析、批量結合或免(mian)疫沉(chen)淀(dian)(IP)等(deng)方式，還能通過(guo)各種常規的中低壓色譜系統(tong)(如AKTA純化(hua)系統(tong))純化(hua)目(mu)標(biao)蛋白。

該產品的親(qin)和配基(ji)Anti-Humanized VHH Antibody對人源(yuan)化(hua)VHH較高的親(qin)和力和特異(yi)性使(shi)其能夠從常用的蛋白質表達系統(如細菌、酵母和哺乳動物細胞)中(zhong)獲得較高純度(du)的人源(yuan)化(hua)VHH(如圖(tu)4所示)。

圖4 柱層析方式(shi)純(chun)化(hua)人源化(hua)VHH示(shi)意圖

產品特性

金斯瑞MonoRab? Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF的主要特性如(ru)下表：

表1 Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF的特性

案例展示

1．Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF從E. coli裂解液中純化(hua)人源化(hua)VHH#1蛋(dan)白。

2．Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF從E.coli裂解液中純化人源化VHH#2蛋白。

3．Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF重復使用次數(shu)

結果表明，該(gai)產(chan)品重復(fu)使用10次后(hou)，載量沒有明顯下降。

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抗體及抗體標記物

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